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    技術服務

    細胞消化傳代和換液傳代經驗


    細胞消化傳代和換液傳代經驗
    1、傳代時消化的問題
    可以這樣說,對于需要消化傳代的細胞,每一次的消化都是對這個細胞存活與否,狀態好與不好*至關重要的考驗。很多同學都遇到過這個問題,自己養的細胞開始的幾代長的還挺好的,可是穿過幾代之后就發現自己的細胞不行了,狀態越來越差勁了。對于這個問題,可以非??隙ǖ卣f,你的消化環節出問題了。你每一次的消化都讓細胞受到較大損傷了。所以,越長越差。在消化的過程中,你加入胰酶后,所有細胞都在被胰酶消化著,但是我們忽視了一個問題就是,細胞的生長狀態是不一樣的,每一個細胞的貼壁情況也是不一樣的,有的貼壁牢固,有的貼壁沒有那么牢固的,所以,讓所有的細胞消化同樣的時間對細胞是不公平的,他們受到了差別待遇當然會有脾氣啊。我后來對消化的方法進行了改良。爭取做到因材施教呵呵。我稱之為“四步消化法”。(以難消化細胞為例)
    具體操作:
    1).首先不加胰酶,倒掉舊培養基加入少量新培養基洗1-2遍,(這是前奏,即為**步,目的是將漂浮著的死細胞之類盡量洗掉。
    2).然后再加入少量新培養基直接吹打一遍,這一遍是把貼壁不牢固的細胞吹打下來。再用培養基洗一遍,兩次所得懸液混合傳入新瓶。即為**步(可以將這些傳入新瓶培養,以與后面胰酶消化過的細胞對比觀察看誰長的更好一點就知道該細胞對胰酶的敏感度了)。
    3).吸干凈瓶內剩余液體,加入0.3ml左右的胰酶潤洗一遍,吸掉棄之,再加入1ml左右的胰酶消化。消化的同時置于顯微鏡下觀察,待細胞與細胞之間間隙明顯的時候立即吸掉胰酶與干凈子彈頭里備用,加入新培養基開始吹打,吹打2-3遍后吸取懸液于試管或新瓶暫存。用2ml左右新培養基洗一遍與前面的混合。(也可以傳入新瓶培養,以與后面及前面的做對比)這是第三步。
    4).然后把前面剛吸出來的胰酶重新加進去瓶里繼續消化剩余的貼壁牢固的細胞。當然你也可以用新的胰酶,如果你們那比較富裕的話,呵呵。繼續鏡下觀察,待剩余細胞間隙明顯,細胞獨立開來的時候,吸掉胰酶,加入新培養基吹打。懸液傳入新瓶培養(根據實際情況你自己把握)。這是第四步。
    其實還可以有第五步,對于特別難消化的細胞和對胰酶特別敏感的細胞的話,你可以繼續加第五步甚至第六步。為了細胞更好的狀態,更漂亮的樣子,沒辦法,你必須分多批多次消化,這樣才能*大限度地將胰酶對細胞的損傷降到*低,保證細胞的狀態能夠*優。
    當然了,如果細胞是屬于那種很容易消化的細胞,像RAW264.7,僅僅**步就搞定了。就沒必要第三步第四步了。這個是需要你在實驗中能夠自己用心去體會的。建議你接受一個新細胞時把各步消化的細胞分別培養起來做比較,去摸索好細胞對胰酶的要求。便于你后續實驗的開展。
    將細胞消化分成這幾步,除了是為了避免胰酶對細胞的損傷之外,還有一個更重要的作用就是,可以*大程度地把細胞吹打成單個單個的狀態,不成片不連體。
    因為細胞生長的時候肯定是要相互聯系,大部分的細胞都是要成片生長的,尤其是對于貼壁細胞,單個細胞貼壁之后長著長著就長到一片去了。但是如果是成片的細胞抱團的話,傳代后細胞是不能貼壁的,這樣抱團的細胞就會死亡。所以,消化傳代的時候一定要將細胞消化成單個單個的獨立狀態,這個啊是非??季磕愕墓Ψ虻?!
    細胞一旦脫落入懸液里你很難再將他吹打成單個,因為他沒有受力點了。很難找到受力點讓你對他吹打的力分散開細胞。所以必須要在細胞未脫落之前將其吹打開,受力點就是細胞貼壁的地方。這樣你就必須要嚴格控制好消化的程度啊,這和大師做飯掌握好火候是一樣的道理啊。既要消化到容易吹打下來,又不能太過,一吹就整片脫落,要單個單個地往下掉。所以我才要分批分次地加胰酶消化就是為了保證不同生長狀態貼壁程度的細胞能夠都維持在好的受力點分散開。這個是很重要的一點。尤其是對于某些細胞這一點就是他活**的致命點。像Caco-2細胞就是如此。
    另外關于傳代很重要一點就是一定不能等到細胞長滿的時候才去消化傳代。要在細胞長到70%左右的時候就要傳代了,一旦發現細胞生長中已經有疊層生長的時候就要立即進行消化傳代。不能再拖了。
    2、關于換液傳代時候洗瓶的問題
    對于用DMEM培養基培養的細胞,你在洗的時候如果是用無血清1640去洗細胞在隨即后的幾次中會比用DMEM洗的長的要好。同樣,用1640培養的也有這個現象。
    如果不嫌麻煩的話,可以用PBS來洗,洗的效果和用無血清培養基洗的效果基本上是一樣的,對于有些細胞會更勝一籌。洗的目的主要是洗去培養瓶里殘留的血清,防止它對胰酶的影響。這樣能夠保證胰酶的消化能力優先,是很關鍵的一點。
    傳代時PBS洗是很重要的一步,*近發現,用PBS就可以把細胞消化開來。加入PBS放置10-15分鐘,有些需要更長的時間,等到細胞一個個分離開來的時候,就可以直接吹打下來,但是和胰酶消化一樣,要控制好時間,不能時間太過了,要不然損傷細胞,細胞不容易成活,狀態容易不好。這個方法對于某些細胞是很管用的。有些細胞用胰酶消化不容易消化成單個的時候,或者臨時沒有胰酶了,可以選用此方法。不過一定要試試,看是否適合你的細胞。
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